FAQ: 脱靶效应的检测与规避方案
Q11. 影响CRISPR靶向性效率和特异性的因素有哪些？
影响CRISPR靶向效率和特异性的因素有：
- gRNA设计：凯发一触即发开发的gRNA设计软件基于NCBI权威文献开发和验证的算法，选择合适目标序列以避免脱靶效应，该算法在目标基因中寻找一个约20bp的序列，在其他位置没有出现与其高度相似的序列。因为gRNA和非目标的内源基因组之间的错配数小于3个时，可能发生Cas9介导的脱靶效应。
- 核酸酶/靶向策略：大多数研究使用从化脓性链球菌中分离的Cas9核酸酶。Cas9 WT 诱导双链断裂，通常通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复，这会引入导致移码和蛋白质表达完全丧失的小段基因嵌入或缺失，这已被证明是在每个细胞系和生物体中引入表型敲除的一种简单有效的方法。另一种策略是使用这种酶的突变体Cas9-D10A(切口酶)，它可用于在目的区域两侧诱导两条单链断裂，以进行更特异的敲除。如果您需要用于不同酶的gRNA序列，或者您对CRISPR靶向策略有其他特殊要求，请发送邮件至oligo@fnlianou.com咨询。
- gRNA序列的数量：通常单个 gRNA 足以敲除目标基因；但是，凯发一触即发建议您为每个目标基因订购三个序列的gRNA，以提高基因组编辑的成功率，避免出现脱靶效应。
在凯发一触即发订购 gRNA质粒 ，凯发一触即发会提供一个经过序列验证的质粒，其中包含gRNA表达和基因组结合所需的所有元素：U6启动子、间隔（目标）序列、gRNA骨架和终止子。凯发一触即发保证提供的gRNA克隆序列准确；然而，鉴于构建基因组编辑细胞系以及转染和实验的复杂性，凯发一触即发无法保证使用凯发一触即发的gRNA进行实验的结果。如果您希望使用CRISPR技术创建经过序列验证的 KO或KI细胞系，请参阅GenCRISPR™基因编辑细胞系服务。
Q12. 如何降低脱靶效应？
降低脱靶效应的方法：
- 选择特异的gRNA；
- 使用RNP；
- 使用eSpCas9的质粒；
- 使用Nickase Cas9。
Q13. 如何检测是否发生脱靶？
基因编辑的脱靶率检测一般有两种方法：
- 选择潜在的脱靶位点，例如选择gRNA预测网站上Top 5潜在脱靶位点，进行Sanger测序单克隆；
- 预算允许的情况下，通过全基因组测序的方法进行全基因组序列的分析和比对更精准，例如基于NGS的iGUIDE方法。
