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检测原理

• 慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒

  凯发一触即发慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒利用了两种抗HIV-1病毒p24蛋白的单克隆抗体，它们可与 p24 蛋白的不同表位结合。

  当标准品或样品加入捕获板时，p24衣壳蛋白可以被包被在捕获板上的抗p24捕获抗体捕获。然后在体系中加入与生物素结合的抗p24检测抗体，该检测抗体可以与捕获板上结合的 p24 蛋白相互作用。随后添加的链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物 (Streptavidin-HRP) 可与生物素偶联的抗 p24 抗体 (Biotin Anti-p24 Antibody) 相互作用。在洗涤步骤后，加入 3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB溶液），可在体系中形成蓝色复合物。通过添加终止溶液终止反应。终止溶液可使的体系颜色从蓝色变为黄色。颜色的强度可以通过酶标仪在 450 nm 处读取。

  测试样品中p24蛋白的浓度可根据 p24蛋白标准曲线实现精确定量。最后可通过p24蛋白浓度和慢病毒滴度换算关系计算得出样品中的慢病毒滴度。

  

  Figure 1: 慢病毒滴度p24 ELISA试剂盒检测原理

验证数据

• 高准确度和回收率

  回收率用于确定分析物检测是否受样品基质差异的影响，通过将已知量的分析物加标到不同的样品基质中来验证回收率。以下是根据具有代表性的准确度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用3批次试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript），将已知量的分析物加标到基质中混合验证回收率，样本重复测量3次。根据性能评估结果，回收率应在80%-120%，则认为样品基质对准确定量分析物的能力影响较小。

  Table 1: 三批次试剂盒回收率测试结果

  批次编号	重复次数	平均测值 pg/mL	回收率
  			实测	标准: 80%-120%
  #1	3	1945.30	86%	符合
  #2	3	1787.64	108%	符合
  #3	3	1752.76	90%	符合

• 高检测精密度

  A. 批内精密度/重复性

  批内精密度验证体现测定板内每孔之间的重复性，有助于确保在测定板的不同孔中运行样本检测可以给出可靠的结果。
  以下是根据具有代表性的批内精密度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript）分别对低、中、高3个浓度水平的样本进行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本计算10次测量浓度结果的平均值（M）和标准差（SD），计算变异系数(CV)。根据性能评估结果，所测结果 %CV应低于10%，表明该测定具有良好的重复性。

  Table 2: 三批次试剂盒批内精密度验证结果

  批次编号	重复次数	平均测值 pg/mL	%CV
  			实测	标准：≤10%
  #1	10	215.55	3%	符合
  #1	10	829.45	4%	符合
  #1	10	1537.42	4%	符合
  #2	10	209.60	5%	符合
  #2	10	792.76	2%	符合
  #2	10	1431.42	3%	符合
  #3	10	188.09	6%	符合
  #3	10	759.99	4%	符合
  #3	10	1377.71	3%	符合

  B. 批间精密度

  批间精密度体现同一样品在多批测定间的重现性，有助于确保在不同批次试剂盒中运行样本检测可以给出可靠的结果。
  以下是根据具有代表性的批间精密度验证生成的报告和数据示例，在这项验证中，使用3个不同批次试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript）分别对低、中、高3个浓度水平的样本进行测试，每个样本各重复检测10次，每个样本计算30次测量浓度结果的平均值（M）和标准差（SD），计算变异系数(CV)。根据性能评估结果，所测结果 %CV应低于15%，表明该测定具有良好的批间精密度。

  Table 3: 三批次试剂盒批间差验证结果

  批次数量	重复次数	平均测值 pg/mL	%CV
  			实测	标准：≤15%
  3	3×10	204.41	7%	符合
  3	3×10	794.07	5%	符合
  3	3×10	1448.85	6%	符合

• 慢病毒纯化生产全流程滴度检测

  使用慢病毒滴度p24试剂盒对慢病毒纯化生产全流程进行慢病毒滴度监测，有利于慢病毒纯化和成产过程控制和优化。凯发一触即发慢病毒滴度p24试剂盒（Cat. No. L00938, GenScript）的超宽线性可以有效减小稀释倍数，从而节约检测时间以及减少稀释过程导致的偏差。

  Table 4a: 凯发一触即发慢病毒滴度p24试剂盒在慢病毒纯化生产全流程的滴度检测

  样品名称	样品OD值	样品检测值 (pg/mL)	稀释倍数	p24浓度 (LP/mL)	CV %
  HM上清液	3.151	2445.918	100	超出检测范围，无效	/
  	1.225	444.343	3000	1.67E+10
  PB核酸酶孵育	3.12	2369.055	100	超出检测范围，无效	/
  	1.242	451.997	3000	1.69E+10
  Centrifugation离心	3.103	2328.92	100	超出检测范围，无效	/
  	0.94	321.172	3000	1.20E+10
  CF-01澄清过滤	3.136	2405.64	100	超出检测范围，无效	/
  	0.926	315.765	3000	1.18E+10
  UF/DF浓缩换液	2.183	1040.264	3000	3.90E+10	3
  	0.152	36.234	90000	4.08E+10
  CF-02澄清过滤	1.994	890.168	3000	3.34E+10	6
  	0.142	32.441	90000	3.65E+10
  GF凝胶过滤	1.496	578.496	3000	2.17E+10	/
  	0.106	18.902	90000	超出检测范围，无效
  UF/DF-02浓缩换液	2.623	1501.37	3000	5.63E+10	3
  	0.185	47.906	90000	5.39E+10
  最终样	3.155	2459.286	3000	超出检测范围，无效	/
  	0.799	265.916	90000	2.99E+11

  Table 4b: 竞品慢病毒滴度p24试剂盒在慢病毒纯化生产全流程的滴度检测

  样品名称	样品检测值 (pg/mL)	样品OD值	稀释倍数	p24浓度 (LP/mL)	CV %
  HM上清液	86.687	1.223	12000	1.30E+10	/
  	291.899	3.143	2000	超出检测范围，无效
  PB核酸酶孵育	100.254	1.375	12000	1.50E+10	/
  	282.872	3.073	2000	超出检测范围，无效
  Centrifugation离心	73.79	1.073	12000	1.11E+10	/
  	275.974	3.019	2000	超出检测范围，无效
  CF-01澄清过滤	69.953	1.028	12000	1.05E+10	/
  	279.996	3.051	2000	超出检测范围，无效
  UF/DF浓缩换液	234.108	2.675	10000	超出检测范围，无效	/
  	39.453	0.653	60000	2.96E+10
  CF-02澄清过滤	212.127	2.484	10000	超出检测范围，无效	/
  	36.317	0.612	60000	2.72E+10
  GF凝胶过滤	165.17	2.048	10000	2.06E+10	5
  	29.342	0.522	60000	2.20E+10
  UF/DF-02浓缩换液	275.001	3.011	10000	超出检测范围，无效	/
  	69.346	1.021	60000	5.20E+10
  最终样	38.46	0.64	480000	2.31E+11	/
  	244.786	2.765	80000	超出检测范围，无效

  * 红色标记数据为超出检测范围数据

  在慢病毒纯化生产的工艺开发过程中，9个工艺过程的18个样品被采集并进行滴度检测。实验结果发现：
  1. 凯发一触即发慢病毒滴度p24检测试剂盒的稀释倍数低于用竞品的p24检测试剂盒的稀释倍数。
  2. 在稀释慢病毒到慢病毒滴度p24检测试剂盒的线性范围的过程中，18个样品使用凯发一触即发慢病毒滴度p24检测试剂盒一次稀释成功率为 67%，而使用竞品p24检测试剂盒一次稀释成功率为 56%。

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