新思路！凯发一触即发助力CRISPR技术应用于靶向PD1的CAR-T治疗

CAR-T发展过程中，科学家利用基因工程的魔法，不断优化改造T细胞，增加其实效性、持续性、安全性、通用性等。以简单快捷的CRISPR为代表的基因编辑技术的崛起，也提供了改造T细胞的新思路，在CAR-T疗法中逐渐展露锋芒。

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什么是CAR-T细胞？嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T疗法）作为细胞治疗中的临床疗效耀眼的佼佼者，通过对T细胞进行基因工程修饰，使其表达CAR，从而独立于MHC呈递，特异性识别肿瘤抗原，最终激活T细胞并介导癌细胞的杀伤。

CAR-T细胞疗法在包括侵袭性B细胞淋巴瘤为代表的血液恶性肿瘤治疗中表现突出。2017年8月，美国食品和药物管理局（FDA）首次正式批准针对CD19的CAR-T细胞疗法Kymriah上市，该疗法在治疗侵袭性急性淋巴细胞白血病中，约76％的患者完全缓解^[1-2]。

CAR-T细胞进阶史1989年，第一代CAR-T只有一个胞内信号传导结构域（主要是CD-3ζ或FcRγ），仅在T细胞表达单链抗体，靶向肿瘤细胞表面抗原分子，但存续时间短，限制了其发挥功效^[3]。

第二、三代，将共刺激信号分子（CD28、4-1BB等）组装进CAR，提升T细胞活化、存续和扩增[4]。第四代CAR-T追加引入促炎细胞因子（IL-12等），在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中，通过释放促炎因子招募并活化更多免疫细胞，引起更广泛的抗肿瘤免疫效应。第五代通用型CAR-T通过敲除异体T细胞可能造成免疫排斥的基因，为CAR-T疗法的大规模生产和即时应用提供了可能。

基于病毒转染技术的CAR-T生产传统技术路线中，通过慢病毒载体（LV）将CAR序列转染进T细胞，从而进行基因组整合，获取CAR-T细胞，这种方法可确保CAR构造的有效整合和稳定表达。然而，在CAR-T细胞生成中使用病毒载体，存在CAR序列可能产生随机基因组整合的缺点，例如潜在的插入突变、异种CAR表达、CAR表达沉默^[5-6]。

同时，病毒转染技术操作复杂、成本高、周期长，增加了CAR-T疗法造价和时间成本，限制了后续CAR-T疗法临床普及应用。

新方法！利用CRISPR靶向插入CARCRISPR/Cas9为CAR结构靶向特定目标基因提供新思路。CRISPR核糖核蛋白复合物由gRNA和Cas9蛋白组成，gRNA中tracrRNA部分与Cas9结合，crRNA部分可识别特定的目标序列，并通过Cas9对目标序列进行剪切。剪切产生双链断裂后，细胞修复机制被激活，可通过非同源末端连接（NHEJ）实现基因敲除，或通过同源性定向重组（HDR），同时加入同源模板实现基因敲入。科学家通过HDR实现长片段DNA序列的靶向插入，并运用于CAR-T细胞的生产。例如，Eyquem etal.利用CRISPR/Cas9（Cas9 mRNA和gRNA）将特异性识别CD19 的CAR，靶向地插入TRAC（编码TCRα链）基因座[7]。该应用中， CD19-CAR DNA供体模板通过免疫原性、整合风险更低的腺相关病毒（AAV6）载体递送进T细胞，从而可以规避上述慢病毒载体可能存在的风险。

凯发一触即发助力CRISPR技术应用于靶向PD1的CAR-T治疗

近期，medRxiv预印本中，Zhang等针对AAVS1安全位点和PD1这两个基因位点，利用CRISPR/Cas9成功开发了CAR-T细胞。该研究中使用了凯发一触即发合成的gRNA。Zhang等将非病毒的CAR的DNA模板（包含CD19抗原识别结构域、4-1BB-CD3ζ信号结构域（19bbz）），通过CRISPR/Cas9靶向插入AAV1基因座，由此生产的CAR-T细胞，与原慢病毒转染模式生产的CAR-T细胞相比，具备类似的扩增能力和肿瘤杀伤能力。同样的，通过类似的CRISPR/Cas9技术，生产包含识别PD1的CAR的T细胞，与原慢病毒转染模式生产的CAR-T细胞相比，zz，更节省时间与经费成本。接下来，另一项临床试验（NCT04213469）旨在评估利用CRISPR/ Cas9技术生产的、靶向PD1的CAR-T细胞在治疗复发/难治性（r/r）侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的安全性和有效性。Zhang等通过电转的方式将核糖核蛋白复合物（spCas9 / PD1-crRNA：tracrRNA）和非病毒CAR DNA模板，转入从患者获取的T细胞。用该方法获得的PD1-19bbz CAR-T细胞治疗没有细胞因子释放综合症和神经毒性在内的严重不良事件，并使两名代表性患者在接受3个月治疗后完全缓解[6]。目前，CRISPR/Cas9基因编辑系统在自体和同种异体CAR-T细胞的开发中的应用发展迅猛，为基于非病毒敲入策略，进行CAR-T细胞基因编辑提供了安全有效的方案。

凯发一触即发提供从筛选、研发到临床申报相关的CRISPR试剂，包含gRNA文库、质粒/病毒/RNP（sgRNA）递送体系、DNA供体模板（ssDNA）、CRISPR编辑细胞系等，支持细胞/基因治疗、基因功能研究、靶点/药物筛选等研究。

凯发一触即发期待以严苛的产品质量、专业的技术支持、领先的技术与周期，助力您的项目快速高效的推进。

参考文献

1.Liu, J., Zhou, G., Zhang, L. & Zhao, Q. Building potent chimericantigen receptor T cells with CRISPR genome editing. Frontiers in Immunology (2019) doi:10.3389/fimmu.2019.00456.

2.Nie, Y. et al. Mechanisms underlying CD19-positive ALLrelapse after anti-CD19 CAR T cell therapy and associated strategies. Biomarker Research (2020) doi:10.1186/s40364-020-00197-1.

3.Zhao, J., Lin, Q., Song, Y. & Liu, D. Universal CARs, universalT cells, and universal CAR T cells. Journal of Hematology and Oncology (2018) doi:10.1186/s13045-018-0677-2.

4.Subklewe, M., Von Bergwelt-Baildon, M. & Humpe, A. ChimericAntigen Receptor T Cells: A Race to Revolutionize Cancer Therapy. Transfusion Medicine andHemotherapy (2019) doi:10.1159/000496870.

5.Chicaybam, L. et al. Overhauling car t cells to improveefficacy, safety and cost. Cancers (2020) doi:10.3390/cancers12092360.

6.Zhang, J. et al. Development and clinical evaluation of non-viralgenome specific targeted CAR T cells in relapsed/refractory B-cell non-Hodgkinlymphoma. medRxiv 2020.09.22.20199786; doi: //doi.org/10.1101/2020.09.22.20199786

7.Eyquem, J. et al. Targetinga CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature (2017) doi:10.1038/nature21405.