引物池助力碱基编辑器, 让遗传变异的大规模功能表征更高效

2月18日，博德研究所的Ruth E. Hanna等在Cell杂志上发表文章，报道了一种利用CRISPR-Cas9胞嘧啶碱基编辑器的基因池筛选方法，用于对人类单核苷酸变异的大规模并行性评估，其中，基于引物池合成的sgRNA文库，为加速研究推波助澜。该研究突破了罕见病研究和癌症基因组学的变异表征瓶颈，对在临床中表征未知功能变异具有深远意义。

研究背景

单核苷酸变异筛选对于表征可能导致某些罕见疾病的突变至关重要。然而，目前的筛选方法还远远不能令人满意。例如，饱和诱变（Saturation mutagenesis）只适用于产生小基因的单核苷酸变异，而利用Cas9介导同源重组修复（Homology directed repair，HDR）的饱和基因组编辑筛选（Saturation genome editing screens）又存在着在人体细胞中效率低下的问题。因此，RuthE. Hanna等意识到需要一种新的筛选方法来实现简单、可预测和可度量的变体筛选。

本研究的图解摘要
*图片来自Cell杂志网站

实验路线

Ruth E. Hanna等使用胞嘧啶碱基编辑器对哺乳动物细胞中的遗传变异进行了混合筛选，以便对其进行定量评估。

凯发一触即发引物池技术，为该研究中sgRNA文库提供了更节省时间与经费成本的高质量建库方案。

实验结果

• 集合化碱基编辑器筛选的可行性

  研究人员将化脓性链球菌sgRNA文库克隆到慢病毒载体中，在黑色素瘤细胞系中，用阴性和阳性选择试验筛选了该文库。从阴性和阳性筛选得到的数据显示，碱基编辑器筛选在两种情况下都能有效识别引入功能丧失型突变的sgRNAs。然后，研究人员在另外4个细胞系中筛选相同的文库，检测细胞类型对靶向泛致死基因sgRNA表现的影响。结果显示sgRNA在所有5种细胞类型中均有一致的表现。

• 乳腺癌致病黄金标准的突变

  通过对2种细胞系中的乳腺癌基因BRCA1和BRCA2进行碱基编辑器筛选，研究人员以较高的准确度鉴定了BRCA1和BRCA2中已知的功能丧失型突变。他们在ClinVar中制定了一套黄金标准变体，注释为致病/可能致病的(pathogenic/likely pathogenic, PLP)或良性/可能良性的(benign/likely benign, BLB)，并发现碱基编辑器筛选能很好地将PLP与BLB变体区分出来。

• 敏感性或耐药性变化的突变

  此外，研究人员探讨了药物-靶标间的相互作用，以筛查引起敏感性或耐药性变化的突变。他们在一个细胞系中筛选与MCL1（一种在癌症中经常上调表达的基因）相关的基因文库，发现MCL1中的错义突变赋予了对BH3类似物的敏感性和抗性。同样，他们设计并筛选了一个PARP1基因相关的文库。PARP1是重要的肿瘤学靶标，原因是它在BRCA1和其他DNA损伤基因的功能丧失型突变的肿瘤中具有合成致死性。研究人员在具有5种临床PARP抑制剂的细胞系中筛选该文库，结果表明，碱基编辑器技术能够有效地进行阴性选择筛选，从而识别那些能增加细胞对药物治疗敏感性的突变。他们还创建了一个预计能够在3584个基因上产生52,034个临床变异的sgRNA文库，并在存在细胞应激因子的情况下对该文库进行了筛选，从而鉴定了许多DNA损伤修复基因中的功能丧失型变异。通过这一系列的实验研究，该研究小组得出结论，碱基编辑器可用于引入和在聚合筛选中评估数以万计的遗传变异。这是一种灵活的、可扩展的、能够对变异进行功能分析的筛选方法。

相关服务

本研究中使用的引物池由凯发一触即发收购的CustomArray合成。引物池合成服务一次性合成多达91,766条引物，序列覆盖率99%以上，碱基单价低至1分钱，让您不再为预算和周期而烦恼，专心进行合成生物学研究、靶向测序及复合DNA文库实验等，将您的所有科研设想变成现实。

参考文献

1.Hanna, Ruth E., et al. "Massively parallel assessment of humanvariants with base editor screens." Cell 184.4 (2021): 1064-1080.