FAQ–His标签蛋白的纯化

• 每次使用都必须要再生层析柱吗？

  不需要，每使用3-5次后再生层析柱即可。

• 使用手册提到裂解平衡液、Wash Buffer和Elution Buffer中含有50mM NaH2PO4和300mM NaCl。可否用50mM PBS替代它们？

  不行，PBS的浓度较低，会导致一些非特异蛋白的结合。

• 细胞裂解和蛋白质纯化需要多少浓度的PMSF？

  凯发一触即发建议PMSF的终浓度为1 mM。

故障排除–His标签蛋白的纯化

故障排除–GST标签蛋白的纯化

故障排除–抗体纯化

故障排除–免疫沉淀反应

eStain^®蛋白染色仪常见问题

• 1. 染色试剂是R250还是G250？

  R250

• 2. 蓝、绿、白三个接口分别对应什么溶液？

  蓝色：染色液，绿色：脱色液，白色：废液

• 3. 浓缩脱色液冻住了怎么使用，会影响后续实验吗？

  用37℃水浴融化，充分摇匀后使用；当环境温度较低时，建议打开空调保持室温稳定

• 4. 使用1.5mm凝胶时，染脱色程序如何设置？

  推荐程序：eStain LG：染色3min，脱色2min、3min、3min；eStain L1：染色3.5min，脱色1.5min、3min、2min；不同1.5mm凝胶的配胶体系、浓度不同也可能导致结果不同，可根据实验结果优化染脱色程序

• 5. eStain LG使用标准染脱色Stain程序（染色3min，脱色2min，脱色3min），想要染色效果更深一些，该如何设置程序？

  可以延长染色时间，如染色5min，脱色2min+3min；或者减少1个脱色循环，如：染色4.5min，脱色3min，但背景可能也会相对变深，需要根据实验表现优化

• 6. 染色夹上的铁片掉了影响染色效果吗？

  不影响

• 7. 染色夹中间断裂怎么办？

  若染色夹网面无损坏，仅夹子中间连接处断裂，一般不影响使用效果；如果损坏较严重，无法使用，可以购买凝胶固定夹配件自行组装（Cat. No. L00767）

• 8. 仪器清洁维护的频率及方法？

  染色夹维护：

  • 凝胶固定夹每使用50次，放入75 %乙醇中浸泡1-4小时（或者每900 ml 75 %乙醇中加入100 ml仪器清洗液母液浸泡），浸泡结束后使用蒸馏水冲洗、晾干；也可以每次使用完毕后浸泡在 75 %乙醇中，使用前用蒸馏水冲洗；
  • 当凝胶固定夹上的网上有褐色斑点，建议将凝胶固定夹放入1 M的NaOH溶液中，浸泡6-12小时左右，用软毛刷进行清洗（请轻柔刷洗或触摸，以防损坏网面），清洗后放入75 %乙醇浸泡1-4小时，浸泡结束后使用蒸馏水冲洗、晾干；

  eStain仪器维护： 

  当通道染色100片凝胶时，需要用清洗液对通道以及管路进行清洗，操作步骤见eStain清洗试剂盒说明书（Cat.No. L00668）

• 9. 仪器开机后，主界面出现“Accumulated XXX run time exceeds maximum”怎么处理？

  按任意键解除，仪器可以继续工作不影响使用；该提示可能是仪器PUMP、valve(1)、valve(2)、valve (3)、channel A、channel B部分使用寿命已经达到预定最大值，建议及时联系工程人员确认是否需要维护，以免造成不必要的损失

• 10. 仪器开机后出现Incomplete program found怎么处理？

  开机检测到在上次关闭仪器前有未完成的程序，安全起见，通道进行强制排液，因此无需任何操作，需等待仪器检测运行结束，仪器将自动跳转主界面。 

eBlot™ L1快速湿转仪常见问题

• 1. eBlot™ L1快速湿转仪和传统湿转相比区别是什么？

  传统湿法转印耗时长、操作繁琐；eBlot™ L1快速湿转仪基于湿转的原理，集合了传统湿转稳定、均匀和半干转快速、高效的优势，同时避免了传统湿转耗时费力和半干转不均匀稳定性差的缺点，仪器自带三个预设程序，能够在9-17分钟内快速高效地实现蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到PVDF膜或NC膜上的过程。

• 2. 蓝、绿、白三个接口分别对应什么溶液？

  蓝色buffer1：转膜液，绿色buffer2：冷却液（推荐使用1%转膜液或纯水），白色：废液。

• 3. eBlot™ L1快速湿转仪出厂默认程序有哪些？

  仪器中自带三个预设程序，Short：2×5min，Standard：3×5min，Long：4×5min，Method 4清洗程序，Method 1-3出厂未设定，客户可根据自身实验情况设置

• 4. eBlot™ L1的功率多大？

  400W

• 5. 海绵可以重复利用吗？

  海绵使用后会变薄，可能导致三明治结构不紧条带转飘、仪器报错等情况

• 6. 海绵上有很多气孔，会对实验结果有影响吗？

  海绵上有小气孔是正常的，不会影响实验结果；如果出现气孔完全穿透海绵的情况，请联系售后：cpbu.techsupport@genscript.com

• 7. 转膜后海绵下半部分浸湿了，上半部分是“干”的？

  转膜过程中转膜夹竖直放置，转膜结束后，海绵上的液体受重力作用向下流淌，造成上半部分仍是干燥的错觉，但实际上在转膜过程中是充分浸润的

• 8. 仪器开机后，主界面出现“Accumulated XXX run time exceeds maximum”怎么处理？

  按任意键解除，仪器可以继续工作不影响使用；该提示可能是仪器PUMP、valve(1)、valve(2)、 valve(3)、channel A、channel B部分使用寿命已经达到预定最大值，建议及时联系工程人员确认是否需要维护，以免造成不必要的损失

• 9. 仪器开机后出现Incomplete program found怎么处理？

  开机检测到在上次关闭仪器前有未完成的程序，安全起见，通道进行强制排液，因此无需任何操作，需等待仪器检测运行结束，仪器将自动跳转主界面

• 10. 仪器清洁维护的频率及方法？

  定时清洁维护仪器可以预防仪器报错、吐泡等问题，延长仪器使用寿命；

  转膜夹维护：每次转膜完成后，用流水冲洗转膜夹四面晾干保存； 建议1个月除锈一次，若夹子生锈严重可视情况增加除锈次数，将柠檬酸（192g柠檬酸或210g一水柠檬酸）溶解到 1L 纯水中，配制成 1M 除锈剂，将夹子浸泡其中8 h或者过夜，用刷子除锈后，用水冲洗夹子晾干；

  eBlot™ L1仪器维护：通道完成30片凝胶转膜后，需要对通道和管路进行清洗，每次约5min；

  •  1) 同时按下 UP 和 SETTING 键直至蜂鸣器蜂鸣，仪器进行管路排空；
  • 2) 准备1L 0.1M NaOH溶液（4g NaOH溶于1L ddH2O）；
  • 3) 设定A通道和B通道运行程序：（操作步骤：在主界面长按SETTING直到蜂鸣器鸣叫，进入程序选择界面，按UP/DOWN选择Method 4程序，长按SETTING按键进入详细参数界面检查程序是否与下表一致，Buffer 1 cycles设定为4，每个循环设定为0 min，Buffer 2 cycles为0，Cooling cycles为0，First buffer为buffer 1，长按SETTING保存，仪器返回主界面，对应通道名称显示为Method 4，A、B两通道都需设定）；

  程序名称	程序内容
  Method 4	Buffer 1	4 times
  	Cycle 1	0min
  	Cycle 2	0min
  	Cycle 3	0min
  	Cycle 4	0min
  	Buffer 2	0 times
  	Cooling cycles	0 times
  	First buffer	Buffer1

  • 4) 将对应蓝色进液管插入0.1 M NaOH溶液中；  
  •  5) 在2个转膜夹中分别放置2块干海绵（放置2块干海绵是清洗过程中不报错的关键），将装有海绵的转膜夹分别插入仪器通道A和通道B中；
  • 6) 通道A和通道B同时运行清洗程序；
  • 7) 清洗程序运行结束后，同时按下UP、SETTING直至蜂鸣器蜂鸣，通道显示倒计时，仪器进行管路排空； 
  • 8) 将2个转膜夹中的湿海绵换成2块干海绵，分别插入仪器通道A和通道B中将进液管插入纯水中，运行清洗程序（注意：如果没有更换干海绵，可能有水外溢出来，请及时长按START终止程序；如果出现not enough buffer报错，先单击SETTING回到主界面，再单击START，仪器重新进液；若再次出现not enough buffer报错，先单击 SETTING 回到主界面，再长按START终止程序，更换新的海绵，重新运行程序)；
  • 9) 清洗程序运行结束后，同时按下UP、SETTING直至蜂鸣器蜂鸣，仪器进行管路排空；
  • 10) 将进液管插到转膜液瓶上，将程序改为正常转膜程序，通道以及管路清洗工作完成。

  必要时可重复步骤2-7，进行1-3次清洗。

  长时间不使用仪器：如果长时间不使用仪器，请在连续运行2次管路排空操作(同时长按UP+SETTING)后断开电源，并将转膜液瓶盖换为密封式瓶盖，防止液体挥发。

  仪器搬动：仪器正常使用后，需要搬动仪器，请确定仪器开机后可以进入主界面，并确认通道内无液体，仪器搬动过程中，请确保仪器水平，防止通道或管路内残余液体洒出。